Зачет по микре 1

1)

Микробиологические лаборатории организуются при больницах и санитарно-эпидемиологических станциях (СЭС). Существуют также специальные лаборатории, в которых работают с возбудителями особо опасных инфекций, вирусологические лаборатории и др. Микробиологические лаборатории занимаются бактериологической диагностикой инфекционных заболеваний, исследуя испражнения, мочу, кровь, мокроту больных с целью обнаружения патогенных микроорганизмов — возбудителей заболевания. Помимо этого, в микробиологических лабораториях проводят санитарно-бактериологические исследования воды, воздуха, смывов с окружающих предметов, рук, пищевых продуктов для обнаружения санитарно-показательных микроорганизмов, указывающих на загрязнение патогенными микробами. При необходимости в объектах внешней среды определяют наличие патогенных микробов.

В связи с тем что в микробиологических лабораториях работают с заразным материалом, помещение их должно быть изолировано от других больничных помещений, пищеблоков, жилых комнат. В состав лаборатории входят:

1) лабораторные комнаты для проведения микробиологических исследований;

2) моечная;

3) препараторская для подготовки лабораторной посуды, приготовления питательных сред и других вспомогательных работ;

4) автоклавная;

5) комната, где производят прием материала и выдачу результатов исследования. Лабораторных животных, необходимых для постановки биологических проб, содержат в специальном изолированном помещении — виварии. В лабораториях, где объем работ невелик, можно объединить моечную и препараторскую, исключить комнату для приема анализов и т. д. Лабораторные комнаты должны быть просторными и светлыми, желательно с ориентацией окон на север или северо-запад, так как для работы необходим рассеянный свет. Стены окрашивают светлой масляной краской, пол покрывают линолеумом, лабораторные столы — пластиком или стеклом, что позволяет их легко дезинфицировать. В лабораторной комнате оборудуют застекленный бокс с предбоксником для проведения работ в стерильных условиях.. В боксе помещают бактерицидную лампу, стол, табуретку. В лабораторных комнатах находится специальное оборудование: термостат (рис. 23), холодильник, шкафы, центрифуга и др. Большое значение имеет правильная организация рабочего места. Рабочий стол устанавливают у окна таким образом, чтобы свет падал сбоку или прямо. На столе должны находиться только необходимые для работы предметы: спиртовка или газовая горелка, штативы, бактериологические петли, банка с дезинфицирующим раствором.

Персонал во время работы должен строго соблюдать следующие правила:

1) находиться в лаборатории можно только в специальном халате и шапочке;

2) в лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, хранить там продукты, принимать пищу;

3) исследуемый материал поступающий в лабораторию, рассматривается как заразный; его ставят на специальный поднос и обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором;

4) во время работы необходимо соблюдать осторожность, следить за чистотой рук, применять технические приемы, исключающие контакт с заразным материалом;

5) исследуемый материал, отработанные культуры подлежат уничтожению;

6) по окончании работы руки, инструменты, рабочее место обрабатывают дезинфицирующим раствором. Культуры микробов, необходимые для дальнейшей работы, ставят в холодильник или сейф и опечатывают.

Уборка помещений лаборатории. Уборку проводят ежедневно до и после работы влажным способом с применением дезинфицирующих средств. Пол протирают 2— 5% раствором карболовой кислоты или хлорамина. Стены, инвентарь и полы один раз в неделю моют горячей водой с мылом. Бокс убирают в конце рабочего дня, а утром перед работой облучают бактерицидными лампами.

Мытье лабораторной посуды. Посуду, содержащую заразный материал и культуры микробов, обеззараживают в автоклаве (рис. 24).

Нельзя обрабатывать посуду дезинфицирующим раствором, так как даже следы его задерживают рост микробов. Стеклянную посуду моют ершами с применением бикарбоната натрия, полужидкого мыла или стирального порошка. Для устранения белого налета стеклянную посуду помещают на 30— 40 мин в 5—10% раствор хлористоводородной кислоты. Сильно загрязненную посуду опускают в слегка подогретую хромовую смесь. Новую лабораторную посуду кипятят 15 мин в воде с мылом, прополаскивают, погружают в теплый 1—2% раствор хлористоводородной кислоты и кипятят 10—15 мин. В пипетки вводят кусок проволоки, на конец которой плотно накручивают кусок ваты, и тщательно протирают их. Предметные и покровные стекла должны быть хорошо обезжирены (нанесенная на стекло капля воды должна растекаться). Стекла, бывшие в употреблении, загрязненные краской и маслом, опускают на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, затем промывают проточной водой и кипятят в 5% растворе бикарбоната натрия 30—40 мин. Вымытую посуду ставят в сушильный шкаф или сушат на воздухе, пробирки закрывают пробками из ваты, заворачивают в бумагу и стерилизуют в сушильном шкафу или печи Пастера (рис. 25).

Техника взятия и доставки материала в микробиологическую лабораторию. Успех бактериологического исследования зависит от правильности взятия материала и своевременной доставки его в лабораторию. В зависимости от характера патологического процесса, места максимальной (избирательной) локализации возбудителя и пути его выделения в окружающую среду исследуют мокроту (при заболеваниях органов дыхания), испражнения (при желудочно-кишечных инфекциях), мочу (при поражении почек и мочевыводящих путей), гнойное отделяемое (из гнойных очагов), кровь (при кровяных инфекциях). 

Материал необходимо брать в стерильную посуду с соблюдением правил, обеспечивающих стерильность.Испражнения собирают в стерильные картонные тарелки или судно, предварительно обработанное раствором хлорной извести и тщательно промытое горячей водой для уничтожения следов дезинфицирующего раствора. Испражнения берут стерильным шпателем и вносят в стерильную пробирку с пробкой, содержащую консервант (глицериновая смесь, фосфатно-буферная смесь и Др.). Можно брать материал специальной стеклянной ректальной трубкой, которую вводят в прямую кишку на 8— 15 см. Мочу берут стерильным катетером в стерильную пробирку или банку. Рвотные массы собирают в стерильную широкогорлую банку, которую закрывают вощаной бумагой, мокроту — в стерильную банку с пробкой или в стерильную чашку Петри. Гнойное отделяемое ран, мазки из зева и носа берут стерильным ватным тампоном на проволоке.

Кровь из вены для посева берут стерильным шприцем, предварительно обработав локтевой сгиб 75% спиртом, и у постели больного засевают в количестве 5— 10 мл во флакон с жидкой питательной средой в соотношении 1 : 10 (10 мл крови в 100 мл питательной среды).Трупный материал для микробиологического исследования необходимо брать в первые часы после смерти, так как в дальнейшем микрофлора кишечника распространяется по всему организму. Кровь из сердца берут стерильным шприцем. Из селезенки, печени и других органов после предварительного прижигания их поверхности вырезают стерильными ножницами кусочек и помещают в стерильный сосуд. При взятии отрезка кишечника или желудка предварительно накладывают две лигатуры выше и ниже места взятия.

На каждый стеклянный сосуд с инфекционным материалом необходимо наклеить этикетку, где указывают фамилию, имя, отчество больного и дату взятия материала. Надписи делают простым карандашом. К материалу, отправляемому в лабораторию, должно прилагаться направление, в котором указываются:

1) название материала;

2) учреждение, направившее материал;

3) фамилия, имя, отчество больного;

4) его возраст; 

5) дата взятия материала;

6) клинический диагноз;

7) цель исследования;

8) подпись направляющего врача. Взятый исследуемый материал должен быть доставлен в лабораторию в кратчайший срок.

Если этот срок удлиняется, материал необходимо сохранять в холодильнике при 4°С или на льду. Материал, содержащий вирусы, должен и при транспортировке находиться в условиях низкой температуры (например, в термосе со льдом).

Доставку инфицированного материала в лабораторию следует производить с соблюдением мер предосторожности: в закрытой посуде, в специальных металлических биксах, пеналах, чемоданах.

Доставка особо опасного материала (от больных холерой, чумой, натуральной оспой и др.) осуществляется в соответствии со специальными инструкциями. Исследуемый материал помещают в плотно закрывающиеся сосуды, обвязывают пергаментом или другим водонепроницаемым материалом, после чего их обертывают салфетками, смоченными 5% раствором фенола или лизола (необходима полная гарантия от попадания дезинфицирующего раствора в банки с материалом!). После этого сосуды помещают в жестяные коробки с крышкой или металлические биксы. При пересылке на далекие расстояния их помещают в деревянные ящики, опечатывают сургучной печатью и делают надпись: «Опасно. Не открывать во время пересылки». Доставка производится специальным транспортом в сопровождении двух лиц (один из них врач).

Поступивший в лабораторию материал регистрируют в специальном журнале. Исследуемый материал в лаборатории можно хранить: неконсервированный — при температуре 4°С не более 1—2 сут, консервированный в 50% глицерине, например кусочки органов и тканей,— в течение недель, а при необходимости длительного хранения — при замораживании до —15—20°С.

Режим работы микробиологической лаборатории зависит от степени опасности работы с тем или иным возбудителем. По степени патогенности и опасности работы все возбудители разделены на группы: 

I — возбудители чумы;

II — возбудители высококонтагиозных эпидемических заболеваний: бруцеллеза, туляремии, сибирской язвы, сапа, натуральной оспы, различных риккетсиозов и др.; 

III — возбудители эпидемических бактериальных инфекций: кишечных, туберкулеза, дифтерии, патогенные анаэробы, спирохеты (возвратный тиф), простейшие (малярия) и др.;

IV — все патогенные кокки, гемоглобинофильные бактерии, сальмонеллы.

Работа с культурами I и II групп инфекций проводится в специальных лабораториях только с разрешения Министерства здравоохранения, III группы — в лабораториях СЭС, IV группы — во всех бактериологических лабораториях. В бактериологической лаборатории существуют специальные формы регистрации и учета исследуемого материала, выделенных культур, их уничтожения, передачи культур патогенных микробов внутри лаборатории и вне ее.

Обязательным является ведение следующих журналов: 

1) форма 1—журнал регистрации материалов (культур), поступающих для исследования; 

2) форма2—журнал выделенных культур и их уничтожения 

3) форма 3 — журнал (для лабораторий, работающих с возбудителями I и II групп) движения микробных культур и материалов, подозрительных на зараженность.

2) Микроскоп световой

— сложный оптический аппарат, предназначенный для наблюдения за живыми и неживыми объектами и их деталями, к-рые не видны невооруженным глазом. Состоит из штатива, осветительной и оптической части. В штатив входят башмак; предметный столик с держателем предметного стекла и двумя винтами, перемещающими столик в двух перпендикулярных направлениях; тубус, тубусодержатель; макро- и микровинты, передвигающие тубус в вертикальном направлении. Для освещения объекта используют естественный (рассеянный) свет или искусственное освещение с помощью стационарно вмонтированных в башмак микроскопа осветителя или осветителя, соединенного с ним через планку (ОИ-19 и др.). В осветительную систему также входят зеркало с плоской и вогнутой поверхностями и конденсор, расположенный под предметным столиком и состоящий из 2 линз, ирисовой диафрагмы и откидывающейся оправы для светофильтров. Оптическая часть включает наборы объективов (см.) и окуляров (см.). В обычном М. с. луч от источника света попадает на зеркало, отражаясь от него и проходя через конденсор, концентрируется на объекте, находящемся на предметном столике. Часть прошедших через объект лучей попадает в объектив, преломляется в нем и дает увеличенное обратное действительное изображение объекта на уровне диафрагмы окуляра. Изображение объекта в плосковыпуклой линзе окуляра — мнимое прямое увеличенное. В целом объектив и окуляр дают обратное мнимое и увеличенное изображение объекта. Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра. В бактериологии обычно используют полезное увеличение в 900 раз (объектив -90 х, окуляр- 10 х). Разрешающая способность М. с. при применении желтого света около 0,2 мкм. С источником УФЛ она может быть повышена до 0,1 мкм Для изучения объектов, к-рые меньше 0,2 мкм и обладают малой контрастностью, используют микроскопию в отраженном свете, подбирая для этого специальные темнопольные кардиоид- или параболоид-конденсоры. Выявление неконтрастных, но различающихся по фазе объектов проводят с помощью фазово-контрастных микроскопов или приставок. Объекты или их части, не видимые в М. с., наблюдают в микроскоп электронный.

3) Электро́нный микроско́п (ЭМ) — прибор, позволяющий получать изображение объектов с максимальным увеличением до 106 раз, благодаря использованию, в отличие от оптического микроскопа, вместо светового потока пучка электронов с энергиями 200 В ÷ 400  кэВ и более (например,просвечивающие электронные микроскопы высокого разрешения с ускоряющим напряжением 1 МВ).

Разрешающая способность электронного микроскопа в 1000÷10000 раз превосходит разрешение традиционного светового микроскопа и для лучших современных приборов может быть меньше одного ангстрема. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальныемагнитные линзы, управляющие движением электронов в колонне прибора при помощи магнитного поля.

Виды электронных микроскопов

Просвечивающий электронный микроскоп

В просвечивающем электронном микроскопе используется высокоэнергетический электронный пучок для формирования изображения. Электронный пучок создается посредством катода. Полученный электронный пучок ускоряется обычно до +200 кэВ фокусируется системой магнитных линз (иногда электростатических линз), проходит через образец так, что часть электронов рассеивается на образце, а часть — нет. Таким образом, прошедший через образец электронный пучок несет информацию о структуре образца. Далее пучок проходит через систему увеличивающих линз и формирует изображение на люминесцентном экране (как правило, из сульфида цинка), фото-пластинке или CCD-камере. Разрешение ПЭМ лимитируется в основном сферической аберрацией. Некоторые современные ПЭМ имеют корректоры сферической аберрации. Основными недостатками ПЭМ являются необходимость в очень тонком образце (порядка 100нм) и неустойчивость(разложение) образцов под пучком.

Просвечивающий растровый электронный микроскоп

Один из типов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), однако есть приборы работающие исключительно в режиме ПРЭМ. Пучок электронов пропускается через относительно тонкий образец, но, в отличие от обычной просвечивающей электронной микроскопии, электронный пучок фокусируется в точку, которая перемещается по образцу по растру.

 Растровый электронный микроскоп

В основе лежит телевизионный принцип развертки тонкого пучка электронов по поверхности образца.

Низковольтный электронный микроскоп

Низковольтный электронный микроскоп — маркетинговое название упрощенного настольного электронного микроскопа, который работает при ускоряющем напряжении всего в несколько кэВ или меньше.

Сферы применения электронных микроскопов

Полупроводники и хранение данных

Редактирование схем

Метрология 3D

Анализ дефектов

Анализ неисправностей

Биология и биологические науки

Криобиология

Локализация белков

Электронная томография

Клеточная томография

Крио-электронная микроскопия

Токсикология

Биологическое производство и мониторинг загрузки вирусов

Анализ частиц

Фармацевтический контроль качества

3D изображения тканей

Вирусология

Стеклование

Научные исследования

Квалификация материалов

Подготовка материалов и образцов

Создание нанопрототипов

Нанометрология

Тестирование и снятие характеристик устройств

Исследования микроструктуры металлов

Промышленность

Создание изображений высокого разрешения

Снятие микрохарактеристик 2D и 3D

Макрообразцы для нанометрической метрологии

Обнаружение и снятие параметров частиц

Конструирование прямого пучка

Эксперименты с динамическими материалами

Подготовка образцов

Судебная экспертиза

Добыча и анализ полезных ископаемых

Химия/Нефтехимия

4 Люминесцентная микроскопия.

Люминесцентная микроскопия (лат. Lumen, luminis свет; греч. Micros малый + skopeo рассматривать, исследовать) – метод микроскопии, позволяющий наблюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур, входящих в их состав.

Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света зависит от химической структуры и от физико–химического состояния микроскопируемого объекта, что и обусловливает возможность использования л.м. в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесценция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1 , некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами. Эта способность флюорохромов к избирательному окрашиванию позволяет проводить люминесцентно – цитологический и люминесцентно – цитохимический анализ.

Для проведения люминесцентной микроскопии используются либо специальные люминесцентные микроскопы, либо приставки к обычным биологическим микроскопам, позволяющие использовать их для наблюдения люминесценции микрообъектов.

Люминесцентный микроскоп снабжен мощным источником освещения с большой поверхностной яркостью, максимум излучения которого находится в коротковолновой области видимого спектра, системой светофильтров, а также интерференционной светоделительной пластинкой, применяемой при возбуждении люминесценции падающим светом. Эта система возбуждения люминесценции падающим светом через опак – иллюминатор имеет ряд преимуществ:

интерференционная светоделительная пластинка с нанесёнными на неё слоями диэлектриков избирательно отражает на препарат более 90% света, возбуждающего люминесценцию, и почти полностью пропускает более длинноволновый свет люминесценции, что позволяет увеличить яркость люминесценции;

объектив микроскопа служит одновременно конденсором осветительной системы; поэтому при использовании высокоапертурных иммерсионных объективов с большим увеличением освещённость препарата и соответственно яркость люминесценции возрастают пропорционально четвёртой степени апертуры объектива;

люминесцентную микроскопию можно сочетать с фазово-контрастной и интерференционной при освещении снизу через конденсор микроскопа.

Источниками освещения для люминесцентного микроскопа чаще являются ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления, а также лампы накаливания: ксеноновые и кварцево-галогенные.

Для возбуждения люминесценции при люминесцентной микроскопии обычно используют длинноволновую ультрафиолетовую, сине-фиолетовую, а иногда и зелёную область спектра, в люминесцентном микроскопе применяют обычно стеклянную оптику и обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в этой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией. Иммерсионные и заключающие среды также должны соответствовать этим требованиям. В качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нелюминесцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт).

Люминесцентная микроскопия органов и тканей — один из современных методов исследования, применяемый в нормальной и патологической гистологии. Основными преимуществами Люминесцентной микроскопии являются высокая чувствительность (чувствительнее обычных цито- и гистохим. методов не менее чем в 1000 раз), легкость количественного измерения содержания различных хим. компонентов ткани и клеток, доступность аппаратуры. Для Л. м. органов и тканей используют первичную и вторичную люминесценцию.

Первичной люминесценцией (люминесцентное свечение. возникающее без предварительной обработки препаратов) с достаточной интенсивностью обладают некоторые вещества, входящие в состав клеток и тканей: витамины (витамин В2 дает желто-зеленую люминесценцию, витамин В1 в щелочном растворе переходит в трихром и дает синюю люминесценцию, каротин люминесцирует желто-зеленым светом, витамин А при облучении в УФ-спектре имеет сине-белую люминесценцию), гормоны (эстрогены, адреналин дают желто-зеленую люминесценцию, серотонин, норадреналин при обработке препаратов парами концентрированной серной кислоты имеют желтую люминесценцию), липопигменты (липофусцин дает красную люминесценцию, цероид— голубоватую) и др. Принцип первичной люминесценции положен в основу цитохимического количественного изучения содержания различных компонентов клеток (в первую очередь, белков) с помощью метода люминесценции в УФ-лучах.

Вторичная люминесценция органов и тканей достигается с помощью обработки препаратов флюорохромами . Акридиновый оранжевый применяют для диагностики рака в цитологических и гистологических препаратах. Этот же краситель используют для определения ранних сроков инфаркта миокарда. Корифосфин и акридиновый оранжевый применяют для выявления кислых мукополисахаридов. Такие флюорохромы. как кофеин 5 и родамин. могут быть использованы для определения гликогена. Фосфин ЗР применяют для определения липидов. С этой же целью используют раствор 3.4-бензпирена в насыщенном растворе кофеина (липиды имеют голубовато-белую люминесценцию). Тиофлавин окрашивает амилоид (зеленая люминесценция), поэтому его широко применяют для диагностики амилоидоза внутренних органов. С помощью раствора раморина в спирте определяют кальций в тканях (зеленая люминесценция). При обработке препаратов раствором солохрома черного удается выявить алюминий (жёлто-оранжевая люминесценция). С помощью родамина 6Ж в лёгких определяют сурфактант (оранжевая люминесценция).

5.Иммерсия (микроскопия)

Иммерсия (иммерсионный метод микроскопического наблюдения) в оптической микроскопии — это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым предметом жидкостидля усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения.

Иммерсионная система — оптическая система, в которой пространство между первой линзой и предметом заполнено жидкостью. Применяемая таким образом жидкость называется иммерсионной.

Принцип действия

Из основной формулы разрешающей способности микроскопа: d = 0,61λ/А, следует, что предел разрешения определяется длиной волны λ и числовой апертурой объектива А. Так как не всегда возможно изменить длину волны (особенно если исследование производится в белом свете), то для достижения лучшего разрешения стремятся применять объектив, имеющий бо́льшую числовую апертуру.

Однако для «сухого» объектива, с показателем преломления среды перед его передней линзой n=1, максимальное значение числовой апертуры объектива не может превысить значение около 0,95.

Для решения этой проблемы берут иммерсионную жидкость, показатель преломления которой n2 и показатель преломления фронтальной линзы n3 выбраны определённым образом. Исходящие от одной точки объекта OP лучи проходят без преломления через иммерсионную пленку и могут «приниматься» фронтальной линзой объектива.

В этом случае числовая апертура увеличивается, а предел разрешения уменьшается в n2 раз.

Дополнительные преимущества

Возникающие на поверхностях покровного стекла и фронтальной линзе объектива паразитные отражения существенно меньше, нежели у «сухих» объективов, а в некоторых случаях паразитные рефлексы могут быть полностью устранены. Это улучшает контраст изображения и позволяет поднять освещённость препарата без вредного влияния на изображение.

Толщина слоя жидкости между объективом и препаратом может меняться, и за счет этого можно в некоторых пределах изменять компенсацию сферической аберрации.

Иммерсионные жидкости

В расчёте объективов микроскопа оптические параметры иммерсионной жидкости (показатель преломления и дисперсия) учитываются при коррекции аберраций оптической системы (исправление кривизны поля, сферических и хроматических аберраций).

Применяются:

Кедровое или минеральное масло (показатель преломления 1,515)

Водный раствор глицерина (1,434)

Физиологический раствор (1,3346)

Вода (1,3329)

Монобромнафталин (1,656)

Вазелиновое масло (1,503)

Йодистый метилен (1,741)

Темнопольная микроскопия

Схема темнопольной микроскопии в падающем свете.Подсветка образца осуществляется сбоку (зеленая линия). Изображение создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца.

Темнопо́льная микроскопи́я — вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. При использовании метода темного поля регистрируются даже незначительные различия в преломляющей способности участков препарата [1]. Основы метода разработаны Р. Зигмонди в 1906 году.

Принцип действия

В оптической микроскопии тёмного поля неоднородности образца рассеивают свет, и этот рассеянный свет формирует изображение исследуемого образца.

Особенностью микроскопа темного поля является способ освещения образца, который осуществляется «сбоку» (зеленая полоса на рисунке). При таком освещении неоднородности, имеющиеся в образце, рассеивают падающий свет и в микроскопе изображение образца наблюдают в рассеянном свете, а освещающий свет «напрямую» не попадает в объектив. Такое освещение называется эпи-подсветкой (EPI-illuminator, EPI—microscope, EPI-objective lens).

Для прозрачных объектов возможно и контровое освещение, но при этом необходимы дополнительные действия, чтобы убрать «прямое поле»: необходимо провести фурье-преобразование полученного изображения и удалить из полученной суммы компоненту, соответствующую «опорной» волне. Это можно сделать, например, с помощью линзы и шаблона, закрывающего небольшой участок в плоскости, где линзой фокусируется «опорная» световая волна. Затем, с помощью второй линзы проводят обратное преобразование Фурье и наблюдают полученную картину визуально. При этом контраст исходного изображения существенно возрастает.

В микроскопах использование метода тёмного поля может быть предусмотрено конструкцией или реализуется установкой дополнительных узлов, таких, как конденсор темного поля ОИ-13.

Преимущества и недостатки

Темнопольная микроскопия хорошо подходит для получения изображений живых и неокрашенных биологических образцов, таких, как отдельные водные одноклеточные организмы.

Основным ограничивающим фактором метода является то, что только малая часть падающего света в итоге формирует изображение, поэтому необходимо применять достаточно мощные источники света, что иногда приводит к повреждениям образца (сейчас иногда используют лазеры).

Темнопольная микроскопия практически лишена артефактов. Однако, интерпретация получаемых изображений требует большой осторожности, поскольку некоторые детали, не видные методом светлопольной микроскопии, видны методом темнопольной микроскопии, и наоборот. На первый взгляд можно было бы сделать предположение, что изображение, получаемое темнопольным методом является просто негативом по отношению к получаемым светопольным методом, однако, на самом деле, каждый из этих методов делает видимым разные особенности образца. В светлопольной микроскопии особенности видимы, если они или производят тени, или имеют отличный от окружения коэффициент преломления и при этом достаточно резкие, в то время как, например, плавные неоднородности не могут быть наблюдаемы этим методом, однако, хорошо заметны на картинках, получаемых методом темнопольной микроскопии.

Применение

Темнопольная микроскопия может применяться для прижизненного изучения неокрашенных биологических объектов — простейших, изолированных клеток, тканевых культур, для исследования субклеточных структур живых неокрашенных клеток.

Темнопольная микроскопия в последнее время используется в производстве компьютерных мышей с тем чтобы обеспечить работу оптических мышей в том числе и на прозрачных стёклах, имеющих микроскопические дефекты или пыль на поверхности.

6. Микропрепарат - предметное стекло с расположенным на нем объектом, подготовленным для исследования под микроскопом. Сверху объект обычно накрывается тонким покровным стеклом. Размеры предметных стекол (25 на 75 мм) и их толщина стандартизированы, это облегчает хранение препаратов и работу с ними.

Различают постоянные препараты, в которых объект, накрытый покровным стеклом, заключён в канадский бальзам или другую прозрачную твердеющую среду, и временные, в которых заливка производится в глицерин-желатин, либо объект помещается в физиологический раствор или просто в воду. Постоянные препараты могут сохраняться без изменений многие десятилетия.

Типы препаратов

В зависимости от характера исследуемого объекта, используются различные типы препаратов

Тотальные препараты. Приготовляются из мелких организмов или небольших их частей. Часто требуют дополнительной обработки в просветляющих растворах. Обезвоженные тотальные препараты могут заключаться в постоянные среды.

Мазки. Применяются в гематологии при изучении крови, для изучения бактерий и простейших. Могут приготавливаться из тканевых элементов.

Влажные мазки фиксируют, не давая исследуемому материалу высохнуть. Затем препарат готовят так же, как наклеенные на стекло срезы.

Сухие мазки высушивают не фиксируя.

Срезы изготавливаются из фиксированных и залитых в пластический материал (парафин, акрил) объектов на микротоме. Для быстрого получения срезов без длительной процедуры обезвоживания применяют замораживающий микротом.

Шлифы приготовляются из материалов, не поддающихся резке на микротоме. Используются преимущественно в петрографии.

Техника приготовления нативных (живых) препаратов

Приготовление мазка

1) с жидкой питательной среды 2) с плотной питательной среды

культуру берут петлей и каплю наносят на предметное стекло наносят

непосредственно на стекло (без воды)небольшую каплю воды, в ко-

торой эмульгируют исследуемый

материал и распределяют по

площади около 2 см2 .

№ препарата пишут на лицевой стороне, а с обратной стороны местонахождения мазка обводят восковым карандашом.

Высушивание

на воздухе высоко над пламенем спиртовки

мазком вверх

3. Фиксация

Цель: — прикрепить микробов к стеклу

- обеззаразить патогенные микробы

- убитые микробы лучше окрашиваются

Методы

физический химический

- над пламенем спиртовки мазком- более щадящий по сравнению

вверх (3 раза круговыми движениями)с физическим: мазок погружа-

ют в фиксатор (этанол, ацетон, формалин и др.) на определенное время

4. Окраска

Методы

простые сложные

(ориентировочные) (дифференцирующие)

1) окрашивают одним красителем 1) используют несколько краси-

анилинового ряда — основным или телей (основная и вспомога-

кислым: — кислый фуксинтельные краски, обесцвечи-

-эозинвающие жидкости (этанол)

— метиленовый синий- метод Грама

— окраска по Нейссеру

- генциановый фиолетовый — Гинса-Бурри (выявление капсул)

— Циля-Нильсена (выявление

спор)

2) используются для изучения 2) используются для определе-

морфологии микроорганизмов ния не только морфологии, но

и химического состава и струк-

туры микробных клеток

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, в которых красящий ион — катион.

Краситель наливают на поверхность мазка на определенное время, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашен.

Методы, используемые для изучения нативных препаратов

Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х.

Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют сухой объектив 8х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х и исследуют препарат.



Страницы: Первая | 1 | 2 | 3 | Вперед → | Последняя | Весь текст